人才强校丨我国农大袁建敏教授和曹云鹤教授在运用α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶协同降解玉米副产物方面取得重要发展
该研讨通过将曲霉菌的序列密码子及表达载体进行优化后大大增强了阿拉伯呋喃糖苷酶酶活，运用毕赤酵母表达的阿拉伯呋喃糖苷酶可以协同木聚糖酶高效降解玉米副产物，对促进玉米减量代替及高效合理地运用低价值玉米副产品供给科学依据。
玉米是一种丰厚的饲料，跟着其出产和加工，会发生了一些低价值的副产品如玉米皮、膨化玉米皮玉米DDGS等。这些玉米副产物是一类具有挑战性的农业残留物，它们的阿拉伯木聚糖（AX）极端杂乱，由一个β-1,4-链接的D-木质吡喃糖基骨架构成，其结尾的α-L-阿拉伯呋喃糖基代替基连接在木糖基单元的O-2或O-3方位。与小麦比较，玉米皮具有更多的乙酰基和AX侧链，可达0.6到0.7。因而，玉米副产物的彻底降解需求在多种酶协同作用完结。α-L-阿拉伯呋喃糖是AX中相对丰厚的代替物。阿拉伯糖代替物的分化可以减轻AX中的空间位阻，为木聚糖酶供给额定的结合点，并显着进步木聚糖酶的水解功率。一同，通过酶处理将农业残留物酶解成单糖和具有利生元活性的低聚木糖（XOS），已经成为生物质降解研讨的一个趋势性课题。本实验室前期发现，根据麦麸AX的结构，选用特异性阿拉伯木聚糖酶组合(木聚糖酶+ α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶+阿魏酸酯酶) 降解不溶性阿拉伯木聚糖(WU-AX)和可溶性阿拉伯木聚糖(WE-AX)，可以更大程度的降解小麦阿拉伯木聚糖，发生益生元，促进肠道有利菌增值，然后改进畜禽肠道健康（文章宣布在J Agri Food Chem, 2016,64:4932-4942；J. Agric. Food Chem. 2018；66:4725−4733；Front. Microbiol, 2021, 12:683905）。一同，运用此酶组合也可以有用降解玉米AX，并通过呼应面优化玉米AX的酶解工艺并说明其改进肉鸡成长功能作用机制（文章宣布在Animals, 2022, 12, 2641； J Anim Sci Biotechno，2023，14:34）。
现在，市面上酶的产品品种很多，但阿拉伯木聚糖侧链酶很少见，构建高活性的侧链酶阿拉伯呋喃糖苷酶将有助于改进玉米阿拉伯木聚糖的运用。因而，本研讨通过毕赤酵母高效表达阿拉伯呋喃糖苷酶，进步阿拉伯呋喃糖苷酶活性。通过体外实验验证阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶协同酶解玉米副产物的作用，对促进玉米减量代替及高效合理地运用低价值玉米副产品供给科学依据。
在这项研讨中，来自泡盛曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（AF）在毕赤酵母X33中异源表达，通过序列密码子和表达载体的优化，AF活性进步了1倍，酶活可达29.04 U/mL，SDS‑PAGE剖析在约95 kDa处得到条带。去糖基化处理后，分子量下降，且比活进步近2倍。通过发酵罐高密度发酵后，酶活可达6,683.9 U/g。蛋白纯化后，SDS-PAGE剖析显现在95kDa处一条明晰的条带，比活可达14.47 U/mg。
半纤维素在结构和组成具有杂乱性和异质性，需求一系列的糖苷水解酶进行有用的水解，要求酶具有较好的pH稳定性和热稳定性。AF的最适催化温度为50℃，最适pH为5.0。AF在60-65℃下坚持稳定，并显现出在2.5-8.0广泛pH范围内具有较好的稳定性。一同，AF表现出较好的热稳定性，在60℃培育3小时后仍坚持了近30%的活性，甚至在65℃培育3小时后也坚持了近20%的活性。外源酶在动物体内发挥作用时会遭到体内酶（胃、胰蛋白酶等）的影响，本研讨进行了体外模仿，以评价饲料添加剂AF是否具有使其可以抵挡动物消化道内消化酶水解的特性。研讨发现，胃胰蛋白酶处理后，AF活性跟着时刻添加逐步下降，但在80分钟胃蛋白酶处理后仍保存56.5%的酶活性，在80分钟胰蛋白酶处理后保存48.04%的酶活性。
GH51宗族运用保存水解催化机制，会从植物多糖中开释非复原端α-L-阿拉伯糖残基。L-阿拉伯糖是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化过程中的一个按捺剂。本研讨发现，AF对L-阿拉伯糖表现出很好的耐受性。在低浓度下（200 mmol/L），L-阿拉伯糖对AF发生了促进作用。当浓度进一步添加时，L-阿拉伯糖对AF活性发生了按捺作用，例如在500mmol/L时，活性被按捺了15.14%。当D-木糖与AF一同孵育时，酶的活性遭到细微的按捺，甚至在某些浓度下反而添加（1,000 mmol/L）。这可能是因为糖和多元醇添加到酶水溶液中，增强了非极性氨基酸残基之间的疏水相互作用，导致蛋白质死板和热活化。这项研讨的成果为评价AF的饲用价值和引荐其作为外源酶的稳定剂供给了理论依据。
酶转化法是工业出产中从生物质中取得单糖和低聚木糖的最新办法之一，为开发和晋级可再生生物质供给了可能性。但是，木聚糖的侧链代替基（如阿拉伯糖和乙酰基）会对木聚糖酶形成空间阻力，然后阻止木聚糖酶发挥作用。因而，AX不能仅由木聚糖酶彻底降解，需求AX支链降解酶的协同酶解。本研讨发现，与独自的木聚糖酶比较，AF与木聚糖酶在降解膨化玉米皮、玉米麸皮和玉米DDGS表现出显着的协同效应，复原糖含量别离为独自木聚糖酶降解的3.6倍、1.4倍和6.5倍，协同效应程度别离进步到4.61、2.44和5.4，而体外干物质降解率别离为17.6%、5.2%和8.8%。离子色谱成果发现，玉米副产物酶解糖化后被转化为具有利生元活性的低聚木糖和阿拉伯糖。一同扫描电镜的成果愈加直观展现了两种酶的协同作用，两酶处理后玉米副产物外表呈现了显着的蜂窝状结构，证明了AF在降解玉米生物质及其副产品中的有利特性，对促进玉米减量代替及高效合理地运用低价值玉米副产品供给科学依据。
该研讨由我国农大动物科技学院袁建敏教授和曹云鹤教授一起辅导完结，动物科技学院2023级硕博连读生李春玥为论文榜首作者。该作业遭到“十四五”要点研制方案项目（2021YFD1301004）和伊品教授作业站的支撑。